研究背景

D-半胱氨酸(D-Cys)对于中枢神经系统中氧化还原稳态的调节发挥着重要作用，其失调与多种神经系统疾病的发病机制密切相关，例如帕金森症，阿兹海默症等。然而，由于缺乏特定的检测工具，原位精确检测大脑D-Cys水平仍然是一个艰巨的挑战。因此，亟需开发一种简单、精准的手段来原位识别并评估脑部D-Cys水平的变化。

研究内容

近日，南开大学化学学院、有机新物质创造前沿科学中心熊虎研究员课题组提出了一系列能够跨越血脑屏障的氟化荧光素酶原底物用于灵敏监测脑部疾病中的D-Cys水平。作者以2-氰基苯并噻唑(CBT)为母体核心，在不同取代位置上引入亲脂性基团(-F, -CF3)设计了一系列氟化荧光素酶原底物(R-CBT)，通过Cys-CBT生物正交反应可以在生理条件下生成D-荧光素，在萤火虫荧光素酶(Luciferase)催化下进行生物发光(图1)。静脉注射后，7'F-CBT可以有效地穿过血脑屏障并与大脑中的内源性D-Cys缩合，在原位形成荧光素酶底物7'F-Luc，产生具有出色信噪比的强大生物发光信号。此外，它成功应用于检测药物诱导的帕金森(PD)小鼠模型中D-Cys的变化，首次揭示了PD大脑中D-Cys的急剧减少，这项工作为推进脑疾病诊断提供了强大且多功能的工具。

图1.跨血脑屏障的氟化CBT的合成，用于脑内D-半胱氨酸的原位检测。

图2. 7'F-CBT表现出改善的 BBB渗透性，并能够在细胞内原位生成荧光素酶底物，以实现长时间的生物发光成像。

作者首先对R-CBT的分子性质进行了研究，辛醇/水分配系数(logP值)说明R-CBT具有更好的亲脂性。转基因细胞中的实时生物发光强度结果表明，4’F-CBT和7’F-CBT均能更有效地穿透细胞，细胞裂解产物的高效液相色谱(HPLC)分析证实了4’F-CBT和7’F-CBT能够在细胞内产生氟化D-Luc。另外，跨膜实验(Transwell assay)结果表明与CBT相比，4’F-CBT和7’F-CBT的血脑屏障通透性得到明显提升。在细胞层面进行生物发光强度的测试，7’F-Luc显示出更明亮和更持久的生物发光信号。分子对接模拟结果揭示了7’F-Luc能够有效地与萤火虫荧光素酶结合，同时保持相对稳定的高亮度生物发光 (图2)。

图3. 7'F-CBT能够在体外对D-Cys进行高灵敏度检测。

其次，作者评估7’F-CBT通过生物发光检测 D-Cys的能力，7’F-CBT显示出对D-Cys的优异检测限 (LOD=1.37 nM)。选择性实验评估了7’F-CBT优异的抗干扰能力。 值得注意的是与L-Cys相比，D-Cys诱导的生物发光增强了894倍，表明萤火虫荧光素酶未能将L7'F-Luc转化为有效的生物发光信号。细胞实验中，随着外源 D-Cys浓度的升高，U87-Luc细胞中的生物发光表现出剂量依赖性增加，活性硫清除剂预处理的细胞显著降低了生物发光信号，通过随后添加 D-Cys恢复了生物发光信号，表明 7’F-CBT在用于灵敏检测活细胞中的内源性和外源性D-Cys领域具有潜在应用（图3）。

图4. 7’F-CBT能够在体内高灵敏地检测D-Cys。

随后，作者对鼠脑中的D-Cys检测进行研究，转基因小鼠成像结果显示7’F-CBT能够可视化小鼠大脑内不同水平的外源性和内源性D-Cys水平。活性硫清除剂预处理组显著降低了大脑中的生物发光强度，超高的脑-身体信噪比（30.6:1）表明点击化学反应集中发生在脑部。局部注射7’F-CBT后的小鼠主要器官以及鼠脑的离体成像结果中，只有对照小鼠的大脑显示出明显的生物发光信号。这些结果表明BBB可渗透的7’F-CBT能够通过生物正交反应原位检测活体小鼠大脑中的D-Cys (图4)。

图5.原位脑肿瘤模型中D-Cys的高对比度生物发光成像。

随后，作者在原位胶质母细胞瘤的小鼠模型中评估 7'F-CBT对D-Cys的体内检测和成像能力。尾静脉注射7'F-CBT后7分钟就在小鼠大脑中检测到强烈且持续的生物发光信号，并在30分钟时达到峰值。与CBT组相比，7’F-CBT组的生物发光强度增加了4.6倍，并且信噪比显着提高（SNR = 69:1）。更重要的是，作者在清醒小鼠中使用 7'F-CBT实现了对D-Cys的无创和视频速率生物发光成像。这揭示了7'F-CBT能够在原位脑肿瘤中积累并发光，从而实时监测内源性D-Cys（图5）。

图6.使用7’F-CBT绘制PD细胞和小鼠模型中的D-Cys水平。

最后，作者用7’F-CBT孵育裂解后的PD模型细胞 (U87-Luc)，随着MPTP (PD模型药物)浓度的增加，细胞的生物发光强度显着降低，表明与正常细胞相比，PD模型细胞中的D-Cys水平显着降低。尾静脉注射7’F-CBT后的PD模型小鼠的大脑发光强度明显低于正常组，表明PD大脑中D-Cys的下调。离体的鼠脑展示了强烈的信号， PD小鼠大脑中的发光强度与正常对照相比降低了2.3倍。 7’F-CBT证明PD小鼠大脑中D-Cys水平降低,表明D-Cys失调在PD模型发病机制中可能发挥作用 (图6)。

总结

总的来说，作者成功开发了一系列氟化萤火虫荧光素酶原底物，通过腈-氨基硫醇生物正交缩合对大脑中的D-Cys进行敏感和无创成像。其中7'F-CBT以极低的检测限来灵敏地检测活细胞和小鼠大脑中的外源性和内源性D-Cys。值得注意的是，通过利用7'F-CBT卓越的BBB穿透能力，在自由移动的胶质母细胞瘤小鼠中实现了内源性D-Cys的实时无创成像。此外，体内7'F-CBT介导的生物发光成像显示PD小鼠大脑中的D-Cys水平显着降低。这项工作通过原位生成荧光素酶底物类似物，建立了富含D-Cys的脑部疾病成像的新范例，为诊断广泛的神经系统疾病提供了强大的工具。

这一成果近期以“Blood-Brain-Barrier-Crossing Fluorinated Luciferase Prosubstrates Enable Sensitive Monitoring of D-Cysteine Levels in Brain Diseases”为题发表在《Angewandte Chemie International Edition》期刊上，文章的第一作者是南开大学博士研究生杨月霞，通讯作者是熊虎研究员，南开大学有机新物质创造前沿科学中心为论文通讯单位。

文献信息

Blood-Brain-Barrier-Crossing Fluorinated Luciferase Prosubstrates Enable Sensitive Monitoring of D-Cysteine Levels in Brain Diseases, Yuexia Yang, Qian Ma, Xinyu Qiu, Zhaoming Chen, Bingbing Zheng, Hu Xiong, Angew. Chem. Int. Ed., 2026, DOI:10.1002/anie.5604948

来源：X-MOL资讯